1.清洗填料:取Anti-ACK-agarose100µL, 用1mL的PBSt洗(用移液槍将填料吹勻)3000轉/分離心去上清,重複3次,再用1mL 的PBS洗1次離心去上清。
2.與抗原結合:加100µL的ACK-OV(1mg/mL),4度放置30min,用1mL 的PBST洗(用移液槍将填料吹勻)3000轉/分離心去上清,重複2次。
3.洗脫抗原:加40µL0.1M HCl混勻,在室溫靜置5min,得抗原洗脫液,加入60µL0.1M Na2CO3中和,混勻,加入100µL0.05M Na2CO3,混勻,3000轉/分離心,取上清包被。
4.稀釋上清液:取50µL的上清液稀釋于100µL0.05M Na2CO3,即上清液稀釋3倍,抗原洗脫液稀釋了15倍。
5.包被:取一條酶标條,每孔先加入100µL0.05M Na2CO3,在第一孔加入100µL稀釋後的上清液,然後按2倍系列稀釋,依次得出抗原洗脫液稀釋度分别為1/30,1/60,1/120,1/240,1/480, 1/960, 1/1920,最後1孔設空白,37度靜置1h,
6.用PBSt洗酶标條3次,每次拍淨。
7.用1%的BSA37℃封閉30min;用PBSt洗酶标條3次,每次拍淨。
8.ACK-HRP用0.1%的BSA+PBST+0.1%HRP穩定劑稀釋後,每孔加100µL,彈勻,37度反應30分鐘,PBST洗4次,每孔加100µLTMB顯色5-10分鐘,每孔加100µL,2M硫酸終止,在450nm讀數,滴度大于1/500為合格。